Уровни регуляции активности ферментов. Регуляция активности ферментов и их способы Молекулярные механизмы регуляции активности ферментов
Являясь единицей живой материи, функционирующей как комплекс открытых биосистем, клетка постоянно обменивается с внешней средой веществами и энергией. Для поддержания гомеостаза в ней существует группа особых веществ белковой природы - энзимов. Строение, функции, а также регуляция активности ферментов изучаются специальной отраслью биохимии, называемой энзимологией. В данной статье на конкретных примерах мы рассмотрим различные механизмы и способы регуляции активности ферментов, присущие высшим млекопитающим и человеку.
Условия, необходимые для оптимальной активности энзимов
Биологически активные вещества, избирательно влияющие как на реакции ассимиляции, так и на расщепление, проявляют свои каталитические свойства в клетках при определенных условиях. Например, важно выяснить, в каком участке клетки протекает химический процесс, в котором участвуют энзимы. Благодаря компартментации (разделению цитоплазмы на участки) антагонистические реакции происходят в различных её частях и органоидах.
Так, синтез белков осуществляется в рибосомах, а их расщепление - в гиалоплазме. Клеточная регуляция активности ферментов, катализирующих противоположные биохимические реакции, обеспечивает не только оптимальную скорость протекания обмена веществ, но и препятствует формированию энергетически бесполезных метаболических путей.
Мультиферментный комплекс
Структурно-функциональная организация энзимов образует ферментативный аппарат клетки. Большинство химических реакций, протекающих в ней, взаимосвязаны. Если в многостадийном продукт первой реакции является реагентом для последующей, в этом случае пространственное расположение энзимов в клетке выражено особенно сильно.
Нужно помнить, что ферменты являются по своей природе простыми или сложными белками. И их чувствительность к клеточному субстрату объясняется прежде всего изменением собственной пространственной конфигурации третичной или четвертичной структуры пептида. Энзимы реагируют и на изменения не только внутри клеточных параметров, таких как химический состав гиалоплазмы, концентрацию реагентов и продуктов реакции, температуру, но и на изменения, происходящие в соседних клетках или в межклеточной жидкости.
Почему клетка разделена на компартменты
Разумность и логичность устройства живой природы просто поразительна. Это в полной мере относится и к жизненным проявлениям, характерным для клетки. Для ученого-химика совершенно понятно, что разнонаправленные ферментативные химические реакции, например синтез глюкозы и гликолиз, не могут протекать в одной и той же пробирке. Как же тогда происходят противоположные реакции в гиалоплазме одной клетки, являющейся субстратом для их проведения? Оказывается, клеточное содержимое - цитозоль, - в котором осуществляются антагонистические химические процессы, пространственно разделено и образует изолированные локусы - компартменты. Благодаря им метаболические реакции высших млекопитающих и человека регулируются особенно точно, а продукты обмена превращаются в формы, свободно проникающие через перегородки клеточных участков. Далее они восстанавливают свою первоначальную структуру. Кроме цитозоля, ферменты содержатся в органеллах: рибосомах, митохондриях, ядре, лизосомах.
Роль энзимов в энергетическом обмене
Рассмотрим окислительное декарбоксилирование пирувата. Регуляция каталитической активности ферментов в нем хорошо изучена энзимологией. Данный биохимический процесс протекает в митохондриях - двумембранных органеллах эукариотических клеток - и является промежуточным процессом между бескислородным расщеплением глюкозы и Пируватдегидрогеназный комплекс - PDH - содержит три фермента. У высших млекопитающих и человека снижение его происходит при повышении концентрации Ацетил-КоА и NATH, то есть в случае появления альтернативных возможностей образования молекул Ацетил-КоА. Если же клетка нуждается в дополнительной порции энергии и требует новых молекул акцептора для усиления реакций цикла трикарбоновых кислот, то ферменты активируются.
Что такое аллостерическое ингибирование
Регуляция активности ферментов может осуществляться специальными веществами - каталитическими ингибиторами. Они могут ковалентно связываться с определенными локусами энзима, минуя его активный центр. Это приводит к деформации пространственной структуры катализатора и автоматически влечет за собой снижение его ферментативных свойств. Иными словами, происходит аллостерическая регуляция активности ферментов. Добавим также, что такая форма каталитического воздействия присуща олигомерным энзимам, то есть тем, чьи молекулы состоят из двух и более полимерных белковых субъединиц. Рассмотренный в предыдущем заголовке PDH-комплекс как раз и содержит три олигомерных фермента: пируват дегидрогеназу, дегидролипоил дегидрогеназу и гидролипоил трансацетилазу.
Регуляторные ферменты
Исследования в энзимологии установили тот факт, что зависит как от концентрации, так и от активности катализатора. Чаще всего метаболические пути содержат главные ферменты, регулирующие на всех его участках.
Они называются регуляторными и обычно воздействуют на начальные реакции комплекса, а также могут участвовать в наиболее медленно протекающих химических процессах в необратимых реакциях, или же присоединятся к реагентам в точках ветвления метаболического пути.
Как осуществляется пептидное взаимодействие
Одним из способов, с помощью которого происходят регуляция активности ферментов в клетке, является белок-белковое взаимодействие. О чем речь? Осуществляется присоединение регуляторных белков к молекуле энзимов, вследствие чего происходит их активация. Например, фермент аденилатциклаза находится на внутренней поверхности клеточной мембраны и может взаимодействовать с такими структурами, как рецептор гормона, а также с пептидом, расположенным между ним и ферментом. Так как в результате соединения гормона и рецептора промежуточный белок изменяет свою пространственную конфирмацию, этот способ усиления каталитических свойств аденилатциклазы в биохимии носит название «активации вследствие присоединения белков-регуляторов».
Протомеры и их роль в биохимии
Эта группа веществ, иначе называемая протеинкиназами, ускорят перенос аниона PO 4 3- на гидроксогруппы аминокислот, входящих в пептидную макромолекулу. Регуляция активности ферментов протомеров будет рассмотрена нами на примере протеинкиназы А. Её молекула - тетрамер, состоит из двух каталитических и двух регуляторных пептидных субъединиц и не функционирует как катализатор до тех пор, пока к регуляторным участкам протомера не прикрепятся четыре молекулы цАМФ. Это вызывает трансформацию пространственной структуры белков-регуляторов, что приводит к высвобождению двух активированных каталитических белковых частиц, то есть происходит диссоциация протомеров. Если же от регуляторных субъединиц отделяются молекулы цАМФ, то неактивный комплекс протеинкиназы снова восстанавливается до тетрамера, так как происходит ассоциация каталитических и регуляторных пептидных частиц. Таким образом, рассмотренные выше пути регуляции активности ферментов обеспечивают их обратимый характер.
Химическая регуляция активности ферментов
Биохимия изучила и такие механизмы регуляции активности ферментов, как фосфорилирование, дефосфорилирование. Механизм регуляции активности ферментов в данном случае имеет следующий вид: аминокислотные остатки энзима, содержащие группы ОН - , изменяют свою химическую модификацию вследствие воздействия на них фосфопротеинфосфатаз. В этом случае коррекции поддается причем для одних энзимов это является причиной, активирующей их, а для других - ингибирующей. В свою очередь каталитические свойства самих фосфопротеинфосфатаз регулируются гормоном. Например, животный крахмал - гликоген - и жир в промежутках между приемами пищи расщепляются в желудочно-кишечном тракте, точнее, в двенадцатиперстной кишке под воздействием глюкагона - панкреатического фермента.
Этот процесс усиливается благодаря фосфорилированию трофических энзимов ЖКТ. В период активного пищеварения, когда пища поступает из желудка в двенадцатиперстную кишку, синтез глюкагона усиливается. Инсулин - еще один фермент поджелудочной железы, вырабатываемый альфа-клетками островков Лангерганса, - взаимодействует с рецептором, включая механизм фосфорилирования тех же пищеварительных энзимов.
Частичный протеолиз
Как видим, уровни регуляции активности ферментов в клетке разнообразны. Для энзимов, находящихся вне цитозоля или органоидов (в плазме крови или в желудочно-кишечном тракте), способом их активации служит процесс гидролиза пептидных связей CO-NH. Он необходим, так как такие ферменты синтезируются в неактивной форме. От молекулы энзима отщепляется пептидная часть, а в оставшейся структуре модификации подвергается активный центр. Это приводит к тому, что фермент «входит в рабочее состояние», то есть становится способным влиять на протекание химического процесса. Например, неактивный фермент поджелудочной железы трипсиноген не расщепляет белки пищи, поступающие в двенадцатиперстную кишку. В ней под действием энтеропептидазы происходит протеолиз. После чего энзим активируется и называется теперь трипсином. Частичный протеолиз - процесс обратимый. Он происходит в таких случаях, как активация энзимов, расщепляющих полипептиды, в процессах свертывания крови.
Роль концентрации исходных веществ в метаболизме клетки
Регуляция активности фермента доступностью субстрата частично рассматривалась нами в подзаголовке «Мультиферментный комплекс». Скорость протекания проходящих в несколько стадий, сильно зависит от того, сколько молекул исходного вещества находится в гиалоплазме или органеллах клетки. Это связано с тем, что скорость метаболического пути прямо пропорциональна концентрации исходного вещества. Чем больше молекул реагента находится в цитозоле, тем выше скорость всех последующих химических реакций.
Аллостерическая регуляция
Ферментам, активность которых контролируется не только концентрацией исходных веществ-реагентов, но еще и веществами-эффекторами, присуща так называемая Чаще всего такие энзимы представлены промежуточными продуктами обмена веществ в клетке. Благодаря эффекторам и осуществляется регуляция активности ферментов. Биохимия доказала, что такие соединения, названные аллостерическими энзимами, очень важны для метаболизма клетки, так как обладают чрезвычайно высокой чувствительностью к изменениям её гомеостаза. Если энзим угнетает химическую реакцию, то есть снижает её скорость - его называют отрицательным эффектором (ингибитором). В противоположном случае, когда наблюдается увеличение скорости реакции, речь идет об активаторе - положительном эффекторе. В большинстве случаев исходные вещества, то есть реагенты, вступающие в химические взаимодействия, играют роль активаторов. Конечные же, продукты, образовавшиеся в результате многостадийных реакций, ведут себя как ингибиторы. Такой вид регуляции, построенной на взаимосвязи концентрации реагентов и продуктов, называется гетеротрофным.
1. Способность к регуляции делает ферменты важ- ными участниками и своеобразными организаторами клеточных процессов в организме человека. Регуля-ция скорости ферментативных реакций в клетке — основной механизм не только контроля и коорди-нации метаболических путей, но и роста и развития клетки, а также ее ответа на изменение окружающей среды.
2. Существует два основных способа контроля скорости ферментативных реакций:
— Контроль количества фермента.
Количество фермента в клетке определяется соот-ношением скоростей его синтеза и распада. Этот спо-соб регуляция скорости ферментативной реакции является более медленным процессом (проявляется спустя несколько часов), чем регуляция активности фермента (практически мгновенный ответ).
— Контроль активности фермента.
Активность фермента может регулироваться пу-тем взаимодействия с определенными веществами, изменяющими конформацию активного центра.
3. Ферменты, регулирующие скорость метаболи-ческих путей:
— обычно действуют на ранних стадиях метаболи-ческих путей, в местах ключевых разветвлений ме-таболических путей;
— катализируют в условиях клетки практически необратимые реакции, протекающие наиболее медленно (ключевые).
Пример 1. Регуляция по принципу обратной связи: в многоступенчатых метаболических путях конеч-ный продукт ингибирует регуляторный (ключевой) фермент процесса.
Первый фермент (Ej) последовательного пути превращения вещества А в вещество Z обычно ингибируется конечным продуктом этого метаболи-ческого пути.
Изменение активности ключевого фермента Е 1 происходит в результате изменения конформа-ции после связывания вещества Z в аллостериче ском центре — участке, удаленном от активного центра. Фермент Е 1 аллостерический.
Регуляция по принципу обратной связи проис-ходит относительно быстро, и часто это первый от-вет клетки на изменение условий.
С другой стороны, фермент Е х будет активным при снижении концентрации вещества Z .
4. Основные виды регуляции каталитической ак-тивности ферментов в клетке и структурные изме-нения ферментов в ходе их активации представле-ны в табл. 2.3.
5. Нарушение синтеза фермента может привести к энзимопатиям, при которых недостаток одного фермента в метаболическом пути может вызвать нарушение образования конечного продукта. В си-лу взаимозависимости метаболических путей де-фект одного фермента часто приводит к целому ряду нарушений в обмене веществ:
.jpg)
Существует вероятность, что избыточно накоп-ленный субстрат может перейти на побочный путь метаболизма с образованием необычного и часто токсичного вещества Bj.
6. Отдельные примеры энзимопатий (дисахаридозы, гликогенозы, агликогенозы, фенилпирови-ноградная олигофрения) будут рассмотрены при изучении следующих разделов.
Регуляция активности ферментов.
Механизмы активирования.
1) Ковалентная модификация (то-есть меняются ковалентные связи ферментов)
а)частичный протеолиз (на пепсиноген и трипсиноген могут действовать не только соляная кислота и энтерокиназа, но и активные ферменты – пепсин и трипсин соответсвенно, то-есть происходит аутокатализ).
б) фосфорилирование и дефосфорилирование. Фосфорилирование осуществляют протеинкиназы.
2) Достраивание активного центра (чаще это ионы металлов, особенно марганца, но в ряде случаев металл соедигяется с серой, а потом сера легче взаимодействует с активным центром).
3) Аллостерическое активирование. Как правило воздействие происходит на ту субъединицу, где нет активного центра (т есть чаще это характерно для олигомеров), но в этой субъединице есть регуляторный участок, на который может воздействовать какой-нибудь метаболит (к примеру, АДФ), при этом субъединица меняет структуру, изменяя заодно и структуру субъединицы, содержащей активный центр, делая его тем самым более доступным для субстрата. Как правило аллостерическое активирование и ингибирование - ϶ᴛᴏ процессы саморегуляции, когда промежуточные или конечные метаболиты регулируют скорость реакции.
Структурная организация фермента в клетке .
Каждая клеточная структура имеет определенный набор ферментов, которые позволяет выполнить определенную функцию. К примеру, митохондрии снабжены ферментами, способными окислять определенные субстраты и утилизировать полученную в результате этого энергию. Ядра (в них идет синтез ДНК и РНК, которые способны хранить и передавать наследственную информацию) и тоже имеют специфический набор ферментов (РНК – и ДНК – полимеразы и т.д.). Лизосомы (разрушают различные сложные соединения) тоже имеют соответствующий набор ферментов (гидролазы, лиазы и т.д.).
Все эти наборы ферментов строго структурированы, то-есть встроены, к примеру, в мембрану митохондрий (дыхательная цепь) в определенном порядке и находятся в комплексе (к примеру, комплекс, обеспечивающий синтез жирных кислот; комплекс, способствующий превращению пировиноградной кислоты) иногда даже говорят об индикаторных (маркерных) ферментах для клеточных структур (сукцинатдегидрогеназа - для митохондрий, РНК – полимераза – для ядра, кислая фосфатаза для лизосом).
В процессе метаболизма активность ферментов постоянно регулируется, то-есть фермент никогда не работает монотонно. Существуют разные пути регуляции активности ферментов:
1) может меняться количество фермента (то-есть либо усиливаться, либо снижаться синтез фермента). Это происходит за счёт изменения экспресии генов.
2) Может меняться химическая модификация фермента (под действием активаторов, ингибиторов, при изменении рН). Это частичный протеолиз, фосфорилирование и дефосфорилирование, сульфирование и т.д.
3) Меняется активность ферментов при действии гормонов (различные механизмы).
4) На активность фермента может влиять сам субстрат или продукт реакции (являясь либо активатором либо ингибитором).
5) В клетках отмечается и явление компартментализациии, то-есть с помощью биологических мембран разграничены ферменты и те субстраты, которые эти ферменты могли бы разрушить, но это не нужно клетке (к примеру, ферменты лизосом-протеиназы, фосфотазы и т.д. отделены от веществ, расположенных в цитоплазме) Или разделяются с помощью мембран взаимонесовместимые в одно и тоже время метаболические процессы (к примеру, синтез жирных кислот идет в цитоплазме, а распад жирных кислот - митохондриях). Не все ферменты подвержены регуляции. Но в цепи ферментативных реакций есть ключевые ферменты, которые и активируются или ингибируются.
Принципы выделения ферментов .
Для обнаружения ферментов используется их свойство специфичности. Берут определенный (специфичный) субстрат, подбирают оптимальные условия (рН, температура) и, добавляют фермент, смотрят идет ли реакция, при этом концентрация субстрата уменьшается, образование продукта повышено. Количественная оценка ферментов дается по их активности (поскольку ферменты содержаться в ничтожных количествах), то-есть определяется скорость ферментативной реакции. Активность ферментов определяют при постоянной температуре (25 или 37 градусах по Цельсию), создавая оптимум рН. Пи этом концентрация субстрата должна быть достаточно высокая. В этих условиях скорость реакции напрямую зависит от концентрации фермента \/ = К[F]. За единицу активноости фермента принимается то его минимальное количество, ĸᴏᴛᴏᴩᴏᴇ в оптимальных условиях вызывает превращение одного мкмоль субстрата за одну минуту.
Удельная активность - ϶ᴛᴏ ферментативная активность, отнесенная на один мг белка. Согласно рекомендациям комиссии Международного биохимического союза по номенклатуре ферментов, предложено для выражения ферментативной активности использовать катал. 1 катал - ϶ᴛᴏ каталитическая активность, способная осуществлять реакцию со скоростью равной один моль в одну секунду.
Регуляция активности ферментов. - понятие и виды. Классификация и особенности категории "Регуляция активности ферментов." 2017, 2018.
Регуляция ферментативной активности - не менее важный для успешного функционирования клетки процесс, чем регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции. Существование этих механизмов позволяет клеткам и всему организму четко координировать осуществление многочисленных разветвленных метаболических реакций, обеспечивая наиболее высокий и экономный уровень обмена веществ, а также быструю приспособляемость к меняющимся условиям окружающей среды. При этом регуляция синтеза ферментов является более медленным механизмом, действующим в течение многих минут или даже часов, в то время как изменение ферментативной активности происходит мгновенно и действует в течение нескольких минут или секунд. Регуляцию активности ферментов можно назвать «тонкой настройкой» клеточного метаболизма.
Регуляция ферментативной активности может осуществляться несколькими путями, среди которых наиболее распространены аллостерическая регуляция и ковалентная модификация .
Аллостерической регуляции подвержены не все ферменты, а лишь те, которые имеют в составе молекулы аллостерический (от греч. аллос – другой и стереос – тело, пространство) центр - участок, отличающийся от активного центра, характеризующийся высоким сродством к регуляторным молекулам.
Подобные ферменты называют аллостерическими. Их активность регулируется при участии низкомолекулярных веществ (эффекторов ), общим свойством которых является способность к взаимодействию с аллостерическим центром, что приводит к искажению конформации белковой молекулы. Это искажение передается активному центру, в результате чего меняются активность фермента и скорость соответствующей реакции.
Эффекторы могут выполнять роль как ингибиторов активности ферментов, так и их активаторов. Примером ингибирования ферментативной активности может служить снижение активности первого фермента пути биосинтеза триптофана у E.coli - антранилатсинтетазы при избытке в клетке триптофана. В данном случае триптофан, как конечный продукт названного биосинтетического пути, служит игибитором активности ключевого фермента, что координирует скорость синтеза этой аминокислоты и позволяет клетке экономить свои ресурсы. Ведь при избытке триптофана, например, когда он присутствует в ростовой среде, клетке незачем расходовать строительные блоки и энергию на его синтез, она может воспользоваться экзогенной аминокислотой. Действительно, экспериментально доказано, что в процессе роста бактерии преимущественно используют добавленные к ростовой среде аминокислоты, пурины и пиримидины и что эти соединения оказывают ингибирующее действие на свой собственный синтез из молекул-предшественников. Поскольку в приведенном случае триптофан является конечным продуктом биосинтетического пути, скорость которого снижается при ингибировании ключевого фермента, такой тип регуляции носит название «ретроингибирование ».
Увеличение активности аллостерического фермента при связывании с эффектором (активатором) можно рассмотреть на примере аспартаттранскарбамоилазы (АТКазы), которая катализирует первую реакцию биосинтеза пиримидинов. Этот фермент активируется аденозинтрифосфатом (АТР) -пуриновым нуклеотидом. Следует отметить, что одновременно АТКаза ингибируется одним из конечных продуктов названного биосинтетического пути - цитидинтрифосфатом (СТР), причем активатор и ингибитор связываются с одним и тем же аллостерическим центром. Таким образом, с помощью регуляции активности одного фермента обеспечивается координация синтеза пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов.
Мутационное повреждение аллостерического центра может обусловить утрату способности фермента связывать молекулы эффекторов и изменять в ответ на это свою активность. Данное явление используется в селекции микроорганизмов для получения мутантов с десенсибилизированными ферментами. Такие микроорганизмы часто являются продуцентами биологически активных веществ, и для их отбора используют аналоги метаболитов. Например, 5-метилтриптофан так же, как триптофан, способен ингибировать активность антранилатсинтетазы, но не заменяет триптофан в составе белка. Поэтому бактерии E.coli не способны формировать колонии на синтетической среде с этим веществом. Однако известны мутанты E.coli, растущие на среде с 5-метилтриптофаном. Эти бактерии содержат в клетках нечувствительную к ретроингибированию (десенсибилизированную) антранилатсинтетазу и синтезируют триптофан в избыточных количествах, выделяя его во внешнюю среду.
Еще одним распространенным путем регуляции активности ферментов служит ковалентная модификация - присоединение или отщепление от фермента небольшой химической группы. С помощью таких модификаций обычно либо полностью неактивная форма фермента становится активной, либо, наоборот, полностью активный фермент инактивируется. К явлению ковалентной модификации относятся: ограниченный протеолиз (укорочение полипептидных цепей), фосфорилирование - дефосфорилирование, аденилирование - деаденилирование, ацетилирование-деацетилирование и др. Например, гликогенсинтетаза клеток млекопитающих, катализирующая превращение глюкозы в гликоген, инактивируется после ковалентного присоединения фосфатной группы к боковой цепи одного из сериновых остатков и снова активируется при отщеплении фосфата. Другие примеры ковалентной модификации ферментов описаны в главе 3.
Особый случай регуляции активности ферментов представляют собой белок-белковые взаимодействия, в которых роль ингибиторов ферментов выполняют особые белки. При таких взаимодействиях блокируется активный центр фермента. Особое значение ингибирование с помощью белков имеет для регуляции активности протеиназ, участвующих в посттрансляционной модификации белков. Это способствует изменению скорости созревания многих важных для клетки белков, а следовательно, и интенсивности процессов, в которых последние принимают участие.
Глава 7. КОФАКТОРЫ
В ряде случаев для осуществления катализа ферменты нуждаются в особых посредниках - кофакторах. Кофакторы представляют собой вещества небелковой природы, которые функционируют на промежуточных стадиях ферментативной реакции (или цикла реакций), но не расходуются в ходе катализа. В подавляющем большинстве случаев кофакторы регенерируются в неизменном виде по завершении каталитического акта.
Разнообразные по химической природе кофакторы можно разделить на две основные группы: коферменты (слабо связаны с ферментом и при катализе отделяются от него) и простетические группы (прочно связаны с ферментной молекулой).
Основные механизмы, согласно которым кофакторы принимают участие в катализе, следующие:
Выполняют функцию переносчиков между ферментами. Взаимодействуя с одним ферментом, переносчик акцептирует часть субстрата, мигрирует к другому ферменту и передает переносимую часть субстрату второго фермента, после чего высвобождается. Такой механизм типичен для большинства коферментов;
Выполняют роль «внутриферментного» переносчика, что характерно, в первую очередь, для простетических групп. Простетическая группа присоединяет часть молекулы субстрата и переносит ее на второй субстрат, связанный в активном центре того же фермента. В данном случае можно рассматривать простетическую группу как часть каталитического участка фермента;
Изменяют конформацию ферментной молекулы, взаимодействуя с ней вне активного центра, что может индуцировать переход активного центра в каталитически активную конфигурацию;
Стабилизируют конформацию фермента, способствующую каталитически активному состоянию;
Выполняют функцию матрицы. Например, полимеразы нуклеиновых кислот нуждаются в «программе» - матрице, по которой строится новая молекула;
Играют роль промежуточных соединений. Иногда фермент может использовать в реакции молекулу кофактора, образуя из нее продукт, но при этом одновременно за счет субстрата образовать новую молекулу кофактора.
Среди известных в настоящее время ферментов примерно 40% способны осуществить катализ только при посредстве кофакторов. Наибольшее распространение имеют кофакторы, осуществляющие перенос восстановительных эквивалентов, фосфатных, ацильных и карбоксильных групп.
Основным положением ферментативной кинетики является представление о фермент-субстратных комплексах (ES). Как в случае неорганических катализаторов, фермент обеспечивает протекание реакции по более эффективному пути, с более низкой энергией активации. Более высокая каталитическая активность ферментативной реакции обусловлена тем, что процесс идет через стадию образования ES. Скорость ферментативных реакций в 10 3 - 10 13 раз выше скорости не каталитической реакции. Такое резкое увеличение скорости обусловлено двумя причинами - эффектом сближения, который наблюдается и в неферментных реакциях и эффектом ориентации, который исключительно результативно осуществляется именно в ферментативных реакциях.
Молекулы ферментов в отличие от других катализаторов имеют очень сложное строение. Это дает возможность реализовать такие механизмы повышения скорости реакций, которые невозможны с небиологическими катализаторами. Здесь возможны взаимодействия особого рода, отсутствующие в обычном катализе. Если допустить, что связывание субстрата на молекуле фермента происходит не в одной, а трех точках, то одно это уже резко увеличивает вероятность необходимых ориентаций и на несколько порядков повышает скорость реакции.
В образовании фермент-субстратных комплексов могут принимать участие ковалентные, ионные, водородные связи, гидрофобные взаимодействия. Каталитическая активность фермента связана с его пространственной структурой, в которой жесткие участки спиралей чередуются с гибкими эластичными линейными отрезками.
При объяснении механизма действия ферментов широкое признание получила гипотеза «индуцированного» или «вынужденного» соответствия Кошленда. В соответствии с этой гипотезой необходимое расположение функциональных групп активного центра фермента происходит под воздействием субстрата. Реакционно-способная конформация всей молекулы фермента и его активного центра возникает в результате деформирующего воздействия субстрата. При этом следует иметь в виду, что индуцированное соответствие создается не только изменением конформации фермента, но и перестройкой молекулы субстрата.
Гипотеза «вынужденного соответствия» была экспериментально подтверждена, когда было доказано изменение расположения функциональных групп активного центра в процессе присоединения субстрата. Специфичность фермента обусловлена, вероятно, возможностью конформационных перестроек активного центра. Если возможности перестройки велики, то фермент может взаимодействовать с несколькими близкими по структуре субстратами и проявляет групповую специфичность, если возможность резко ограничена, то фермент высоко специфичен.
Гипотеза индуцированного соответствия предполагает наличие между ферментом и субстратом не только пространственной комплементарности, но и электростатического взаимодействия, обусловленного противоположно заряженными группами субстрата и фермента.
В организме реализуется одновременно огромное количество биохимических реакций важных для процессов жизнедеятельности, которые должны строго регулироваться в соответствии с потребностями организма. Эта регуляция должна обеспечивать поставку необходимых компонентов в заданный отрезок времени с наименьшими затратами энергии. Так как практически любая биологически важная реакция - это ферментативная реакция, то ясно, что такая регуляция осуществляется главным образом путем контроля ферментов, катализирующих ключевые метаболические реакции.
Скорость образования конечного продукта метаболического пути может регулироваться или путем изменения активности соответствующих ферментов или путем увеличения или уменьшения числа молекул фермента (индукция или репрессия).
Регулирование активностей ферментов в клетке происходит различными путями. Для большинства ферментов, которые подчиняются уравнению Михаэлиса-Ментен, важным регуляторным фактором является концентрация субстрата. Была введена величина К м представляющая концентрацию субстрата, при которой скорость реакции составляет 50% максимальной. Так как в клетке концентрация субстратов близка к К м или несколько ниже ее, то незначительные изменения концентрации субстратов приводят к относительно большим изменениям скоростей реакций.
Регуляция активности фермента может осуществляться за счет прямого воздействия на центры связывания субстрата, например, ингибирование фермента аналогами субстрата.
Прочно связываются с активным центром фермента ингибиторы белковой природы. Например, ингибитор трипсина - белок с молекулярной массой 6000. Он обладает сильным ингибирующим эффектом, так как строго комплементарен структуре активного центра фермента.
Однако гораздо чаще встречается аллостерический (нековалентный) тип регуляции активности ферментов.
Аллостерическая регуляция характерна для ферментов, состоящих из 2 и более субъединиц и имеющих более одного субстратсвязывающего центра. Эти ферменты содержат аллостерические центры (отличные от субстратсвязывающих), которые способны связывать определенные вещества, носящие название аллостерических эффекторов. Если связывание эффектора снижает скорость ферментативной реакции, то его называют аллостерическим ингибитором, если увеличивает - аллостерическим активатором. В качестве аллостерических эффекторов ферментов выступают различные метаболиты, гормоны, коферменты. Одним из путей регуляции аллостерических ферментов является угнетение посредством «отрицательной обратной связи» или «ретроингибирование», т.е. угнетение конечным продуктом реакции. Некоторые молекулы ферментов имеют несколько аллостерических центров, одни из которых специфичны к положительным, другие к отрицательным эффекторам. Аллостеричекие центры ферментов так же, как и активные центры, могут проявлять резко выраженную специфичность, когда они могут связывать только один определенный эффектор или относительную, когда может происходить связывание сходных по структуре эффекторов.
Механизм действия аллостерического эффектора связан с изменением конформации субъединиц из которых построен фермент, что сказывается на каталитической активности фермента.
Аллостерическая регуляция является одним из самых тонких и высоко специфичных механизмов «быстрого реагирования» на те или иные процессы в окружающей среде и используется для точной настройки метаболических систем. Эффектор может действовать только в одной или нескольких тканях организма и быть связанным со строго определенным звеном метаболизма.
Для аллостерических ферментов характерно явление кооперативности. Оно проявляется в том, что каталитические центры субъединиц взаимодействуют не автономно, а взаимосвязано. Взаимодействие с субстратом или эффектором одного из таких центров усиливает способность к взаимодействию остальных активных центров (положительная кооперативность). В некоторых случаях связывание одним активным центром субстрата понижает способность к связыванию остальных центров (отрицательная кооперативность).
Наиболее хорошо положительная кооперативность изучена на примере молекулы гемоглобина, которая имеет четыре связывающих 0 2 участка (группы гема). Связывание молекулы кислорода одним центром, приводит к усиленному взаимодействию с кислородом остальных участков. Сродство гемоглобина к 0 2 к последней (четвертой) группе более чем в 100 раз больше, чем к первой. Так как связывающие кислород участки разделены в молекуле большими расстояниями, то они не могут взаимодействовать непосредственно. Очевидно, при оксигенировании меняется конформация молекулы в целом, что приводит к изменению сродства связывающих участков.
Кооперативность также является одним из путей регуляции активности ферментов.
Активность фермента может изменяться и в результате, так называемой ковалентной (посттрансляционной) модификации, при которой происходит или отщепление части молекулы или присоединение к ферменту небольших групп. В обоих случаях эти модификации молекулы фермента связаны с разрывом или образованием ковалентных связей.
Известно, что протеолитические ферменты желудочно-кишечного тракта (пепсин, трипсин, химотрипсин) синтезируются в виде неактивных предшественников - проферментов. Регуляция активности фермента в этом случае заключается в том, что под действием специфических веществ (ферментов) неактивная форма превращается в активную. Так, например, трипсин синтезируется в поджелудочной железе в виде трипсиногена, который, попадая в тонкий кишечник, под действием фермента энтерокиназы превращается в трипсин. При этом от трипсиногена отщепляется гексапептид. Трипсин в свою очередь разрывает одну пептидную связь в химотрипсиногене, что приводит к структурным изменениям в активном центре и превращает его в активный химотрипсин.
Превращение пепсиногена в активную форму пепсин также связано с отщеплением пептида от молекулы неактивного пепсиногена. Синтез протеолитических ферментов в виде проферментов имеет важное значение в процессе регулирования процесса пищеварения в желудочно-кишечном тракте.
Регулирование активности протеолитических ферментов в желудочно-кишечном тракте происходит не только превращением профермента в активный фермент, но и путем связывания ферментов с естественными ингибиторами. В слизистой оболочке желудка и кишечника были найдены низкомолекулярные белки, ингибирующие действие пепсина и трипсина. Весьма активный ингибитор пепсина был выделен из желудка свиньи, а ингибитор трипсина из поджелудочной железы.
Ковалентная модификация фермента с изменением его активности может происходить не только в результате разрыва пептидных связей, а путем присоединения к молекуле фермента специфической группы. Например, регуляция активности фермента гликогенсинтетазы, играющего основную роль в тонкой регуляции синтеза гликогена осуществляется путем фосфорилирования и дефосфорилирования его.
Фосфорилирование с участием протеинкиназ является распространенной формой регуляции активности ферментов путем ковалентной модификации. Активность большого числа ферментов и интенсивность соответствующих процессов обмена веществ определяется соотношением фосфорилированных и дефосфо - рилированных форм этих ферментов.
Регуляция ферментативной активности может осуществляться за счет усиления синтеза уже имеющихся ферментов или даже новых ферментов в ответ на изменившиеся условия существования (появление новых пищевых факторов, химических веществ).
При воздействии специфических веществ «индукторов» или «репрессоров» происходит соответственно инициация или подавление процесса транскрипции. Эта регуляция, осуществляемая в процессе биосинтеза фермента, может приводить к изменению концентрации фермента, изменению типов имеющихся в клетке ферментов и изоферментного состава.
Этот путь регуляции более медленный, так как связан с изменением биосинтеза белка. Поэтому между сигналом о необходимости изменения концентрации фермента и установлением его нового содержания пройдет определенное время - от нескольких часов, до нескольких дней. Следовательно, путем изменения концентрации фермента, быстрого регулирования скоростей реакций добиться нельзя. Однако, в тех случаях, когда необходимо не быстрое изменение метаболизма, а продолжительная регуляция метаболического процесса этот путь приобретает важное значение.
Например, в случаях необходимости стимуляции глюконеогенеза происходит повышение концентрации таких ферментов как глюкозо - 6 - фосфатаза, фруктозо -1,6 - бисфосфатаза и фосфоенолпируваткарбоксилаза. Потребность в повышенных количествах этих ферментов обусловлена тем, что они катализируют реакции в обход физиологически необратимых этапов прямого цикла.
Показано, что при метаболическом ацидозе у животных усиливается синтез глутаминазы. Это связано с необходимостью нейтрализации аммиаком накапливающихся в организме кислых продуктов.
Имеющиеся в литературе данные говорят о том, что индукция или репрессия ферментов могут вызываться диэтическими факторами.
Введение глюкозы крысам, предварительно голодавшим в течение 5 дней, вызвало резкое повышение активности глюкокиназы. Так как инъекция пуромицина или актимицина Д подавляли эту активацию, был сделан вывод о том, что причина повышения активности фермента объясняется увеличением его синтеза (пуромицин тормозит синтез белка, а актиномицин - синтез мРНК).
Хорошо известна зависимость между активностью ферментов цикла мочевинообразования и количеством белка в рационе. Повышение содержания белка в рационе сопровождается повышением активности этих ферментов, причем это повышение пропорционально интенсивности синтеза мочевины. Не было обнаружено изменения кинетических свойств ферментативных молекул, наличие каких-либо ингибиторов или активаторов, что позволило сделать заключение, что увеличение активности связано с повышеным синтезом соответствующих ферментов.
Велико значение индукции ферментов при патологии. Индукция ферментов часто сопряжена с развитием защитных процессов при возникновении патологических состояний организма. В то же время следует иметь в виду, что в некоторых случаях усиленный синтез ферментов в ответ на изменение внешних условий среды может привести к развитию патологического процесса.
В ряде случаев при поступлении в организм лекарственных или других чуждых ему веществ также происходит индукция ферментов. Однако это не всегда способствует адаптации организма к новому для него веществу и не всегда обеспечивает более благоприятные условия для жизнедеятельности организма, так как продукт ферментативного превращения может быть более токсичен, чем исходное вещество. В этом случае эффект будет отрицательный.
Способностью индуцировать образование ферментов, как установлено, обладают многие лекарственные вещества - барбитураты, летучие анастетики, гипогликемические вещества, анальгетики, инсектициды и др. Этим явлением можно объяснить наблюдающиеся часто привыкание к некоторым лекарственным веществам при их длительном применении.
Например, при экспериментальном введении собакам фенилбутазона у животных повышалось его содержание в крови и наблюдалось явление интоксикации. Повторное введение этого препарата уже не вызывало столь резко выраженного повышения его в крови и токсического эффекта.
Индукция ферментов фармакологическими веществами часто не является узкоспецифической. Часто образуются ферменты, способствующие превращению не только данного вещества - индуктора, но некоторых других лекарственных веществ. Например, введение в организм пентабарбитурата приводит к усилению метаболизма не только этого вещества, но вызывает усиленное окисление и гексабарбитурата и даже веществ, не относящихся к группе барбитуратов.
Говоря о метаболизме лекарственных веществ в организме нужно иметь в виду, что он может осуществляться не только за счет индукции ферментов, но также путем аллостерической и ковалентной модификации ферментов.
Принципы клинической энзимодиагностики
